پروژه بررسی عفونت تنفسی کلاستر مایکوئیدس در گله های نشخوارکنندگان با کشت و PCR

بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته مایکوئیدس و مایکوپلاسما کاپری کولوم واریته کاپری کولوم در گوساله ها و بزهای کشتار شده به روش PCR

مقدمه

عفونت پلوروپنومونی واگیر، بیماری تحلیل برنده تنفسی است که با جای گرفتن در طبقه بندی بیماریهای سازمان جهانی کنترل بیماریهای واگیر، لزوم و اهمیت شناسایی آن مشخص شده است. عامل اصلی این بیماری، گونه مایکوپلاسما مایکوئیدس می باشد که تایپ کلونی کوچک آن بطور اختصاصی به گله های گاو، خسارات فراوانی ناشی از همه گیری گسترده و مرگ و میر فراوان تحمیل کرده است.

کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس در برگیرنده مهمترین پاتوژنهای تنفسی نشخوارکنندگان است که سالیانه، خسارات اقتصادی سنگینی بر صنعت دامپروری کشورهای جهان وارد می کند. اخیرا شیوعهای بازپدیدی از عفونتهای پلوروپنومونی نشخوارکنندگان در منطقه خاورمیانه گزارش شده است. در این شرایط تعیین وضعیت گله های کشور از نظر آلودگی به گونه های پاتوژن این کلاستر، از اهمیت خاصی برخوردار است. هنوز گزارشی از شناسایی و جداسازی گونه های درگیر از عفونت پلوروپنومونی در ایران بدست نیامده است. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک در نمونه های بالینی و دشواریهای فراوان جداسازی میکروارگانیسم، به ضرورت شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی جایگزین افزوده است.

خصوصیات کلی مایکوپلاسما

مایکوپلاسماها، جزو کوچک ترین پروکاریوت هایند (μm١٥-٠)که قادرند از فیلترهای مخصوص باکتری (μm٤٥-٢٢/٠) عبور کنند. این اجرام به دلیل فقدان دیواره سلولی، اشکال پلی مورفیک دارند و به اشکال کروی (μm٣/٠-٩/٠)، رشته ای (تا μm١)،گلابی شکل، شاخه ای و مارپیچیدر زیر میکروسکوپ الکترونی دیده می شوند. در واقع، بیشتر شبیه به فرم L باکتری ها می باشند.ارگانیسم از سه ارگانل شامل غشا سلولی، ریبوزوم و مولکول حلقوی DNA تشکیل شده است. تصویر مایکوپلاسما در زیر میکروسکوپ الکترونی، شبیه فیلامان (بطری) است که از دو انتها طویل شده است. این اندامکهای انتهایی، محل اتصال به غشا یوکاریوت است که دارای یک ساختمان مرکزی میله مانند می باشد و توسط غشا احاطه شده است.

مقاومت مایکوپلاسماها

این اجرام توانایی تولید دیواره سلولی پلی مورفیک و پپتیدوگلیکانی را دارند و از همین رو، به آن ها باکتری هاییبا نقص دیواره سلولی اطلاق می شود. آنتی بیوتیک هایی که بر روی دیواره سلولی اثر می کنند، (دسته بتالاکتامز) مانند پنی سیلین و سفالوسپورین، آن ها را از بین نمی برند.

طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس

اعضا این کلاستر شامل مایکوپلاسما مایکوئیدس مایکوئیدس کلونی کوچک (MmmSC)، مایکوپلاسما مایکوئیدس مایکوئیدس کلونی بزرگ (MmmLC)، مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری پنومونی (Mccp)، مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری کولوم (Mcc)، مایکوپلاسما مایکوئیدس کاپری (Mmc)، سروتیپ 7 سویه گاوی (M.bsg7)، مایکوپلاسما پوتری فیکنس (M.putrificans)، مایکوپلاسما کووتی (M.cowetti) و مایکوپلاسما یستی (M.yeasti) می باشند. دو گونه آخر جز مایکوپلاسماهای ساپروفیت اند که بیماری زایی آن ها در شرایط عادی در نشخوارکنندگان نامعلوم است و پوتری فیکنس از مبتلایان به سندروم نقص ایمنی انسان نیز جدا شده است.

فاکتور حدت

علی رغم مطالعات گسترده در این زمینه، مکانیسم بیماری زایی MmmSC هنوز ناشناخته است. به هر حال، تئوری هایی وجود دارند که به صورت تجربی مورد آزمایش قرار گرفته اند. در سال 1976، نشان داده شد که تزریق داخل وریدی کپسول MmmSC به گوساله ها، موجب ادم ریوی در مبتلایان به CBPP میشود. از این رو، عنوان شده است که اثرات سمی کپسول برروی دیواره رگها ،بصورت مستقیم است.

کشت و رشدگونه کاپری کولوم

محیطی که به وسیله مک اون و مینتبرای کشت Mccp استفاده گردید، به نام محیط VFG نامیده شد که شامل محیط کشتی مایع از عصاره کبد و سرم بز است. از محیط های جایگزین مناسب می توان از محیط WJ، محیط Hay Flick اصلاح شده، محیط تریپتوز نوینگ نام برد.

اختصاصیت میزبان

در شرایط طبیعی، بیماری CBPP در گاوهایی از گونه گاوسانان اتفاق می افتد، هم چنین بیماری در بوفالو، یاک، بیسون و حتی گوزن،دیده شده است.حساسیت طبیعی گاوها بین نژادهای متعدد و افراد یک جمعیت متفاوت است. گاوهای جوان تا زیر 3 سال ،نسبت به گاوهای مسن مقاوم ترند. به نظر می رسد که نژاد BOS نسبت به سایر نژادها، به بیماری حساس تر باشد. علاوه بر این، نژادهای اروپایی نسبت به نژادهای آفریقایی حساس تربنظر میرسند. بهبودی پس از بیماری، منجر به مصونیت همیشگی می شود.

فهرست مطالب پایان نامه

امقدمه

چکیده

فصل اول:کلیات

تاریخچه

خصوصیات کلی مایکوپلاسما

مقاومت مایکوپلاسماها

طبقه بندی مایکوپلاسماها

طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس

فیلوژنی

ساختمان

ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس

ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم

بیولوژی مولکولی

توالی های تکراری

پروتئینهای سطحی

فاکتور حدت

آنالیز پروتئین

طبقه بندی سویه ها

مشخصات گونه مایکوئیدس

کشت و رشد گونه مایکوئیدس

کشت و رشد گونه کاپری کولوم

محیط Thiacourt

بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان

علائم بالینی

علائم کالبدگشایی بیماری

پاتوژنز

مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی

اختصاصیت میزبان

انتقال بیماری

سیر همه گیری

مخزن

راه انتقال

پیشگیری و کنترل

اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری

اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری

اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی

بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان

علائم بالینی

علائم کالبد گشایی

گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم

سندروم MASKePs

علائم بالینی

علائم کالبد گشایی

سندروم آگالاکتیه واگیر

گونه مایکوپلاسما کاپری

بیماریزایی

علائم کالبد گشایی

سیر همه گیری

مخزن

راه انتقال

جمعیت میزبان

پیشگیری وکنترل

اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری

اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری

اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی

واکسن

واکسن MmmLC

واکسن Mccp

واکسن Mcc

اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس

تشخیص افتراقی

شناسایی عامل بیماری زا

بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی

تشخیص آزمایشگاهی

روش کشت و جداسازی

انتخاب نمونه ها

آماده سازی نمونه ها

تستهای بیوشیمی

روشهای سرولوژی

عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی

تست مهاری رشد

تست ایمونو فلورسانس

تست رسوب ژلی

تست فیکساسیون کامپلمان

تست ممانعت از هماگلوتیناسیون

تست آگلوتیناسیون لاتکس

تست الیزای رقابتی

سایر تستهای تشخیصی

مشکلات روشهای سنتی

تشخیص با استفاده از PCR

فصل دوم: روش کار

روش کار

جمع آوری نمونه

مواد لازم

بخش جمع آوری نمونه

نمونه برداری

کشت و جداسازی نمونه ها

مواد لازم

طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان

مواد لازم

روش تهیه محیط کشت

استخراج DNA مایکوپلاسما

روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی

فرایند PCR

مواد لازم

آماده سازی مواد جهت واکنش PCR

افزوده سازی DNA نمونه ها

افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده

تهیه مخلوط اصلی اولیه

پرایمرها

واکنش PCR

تهیه ژل الکتروفورز

طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید

الکتروفورز

رویت باندهای ایجاد شده

فصل سوم: نتایج

نتایج

جداسازی

بررسی عملکرد محیط کشت

نتایج کشت نمونه های ارسالی

نتایج روز پنجم

نتایج روز هفتم تا دهم

نتایج روز پانزدهم

نتایج PCR

نتایج PCR نمونه ها با پرایمر جنس

تائید کلونی های جدا شده

نتایج PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس

نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه

نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ

نتایج کالبد گشایی

معیار انتخاب

فصل چهارم: بررسی نتایج

نمودارها

فصل پنجم: بحث

بحث

ضایعات کالبد گشایی

میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما

روش کشت

روش PCR

فراوانی گونه ها

خلاصه انگلیسی

منابع